第九章 基因工程和基因組學(xué)

1．什么是遺傳工程？它在理論上和實(shí)踐上有什么意義？
答：遺傳工程是將分子遺傳學(xué)的理論與技術(shù)相結(jié)合，用來(lái)改造、創(chuàng)建動(dòng)物和植物新品種、工業(yè)化生產(chǎn)生物產(chǎn)品、診斷和治療人類遺傳疾病的一個(gè)新領(lǐng)域。
　　廣義的遺傳工程包括細(xì)胞工程、染色體工程、基因工程、細(xì)胞器工程等。狹義的遺傳工程即是通常講的基因工程。本章只涉及狹義的遺傳工程，即基因工程。
　　理論意義：遺傳工程（基因工程）中的DNA重組主要是創(chuàng)造自然界中沒(méi)有的DNA分子的新組合，這種重組不同于精典遺傳學(xué)中經(jīng)過(guò)遺傳交換產(chǎn)生的重組。
　　實(shí)踐意義：遺傳工程（基因工程）技術(shù)的建立，使所有實(shí)驗(yàn)生物學(xué)領(lǐng)域產(chǎn)生巨大的變革。在工廠化生產(chǎn)藥品、疫苗和食品；診斷和治療遺傳疾??；培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物等方面都有非常重大的意義，即基因工程技術(shù)已廣泛用于工業(yè)、農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)、醫(yī)學(xué)、法學(xué)等領(lǐng)域，為人類創(chuàng)造了巨大的財(cái)富。（詳見(jiàn)第10題）。

2．簡(jiǎn)述基因工程的施工步驟。
答：基因工程的施工由以下這些步驟：
⑴.從細(xì)胞和組織中分離DNA；
⑵.利用能識(shí)別特異DNA序列的限制性核酸內(nèi)切酶酶切DNA分子，制備DNA片段；
⑶.將酶切的DNA片段與載體DNA（載體能在宿主細(xì)胞內(nèi)自我復(fù)制連接），構(gòu)建重組DNA分子；
⑷.將重組DNA分子導(dǎo)入宿主細(xì)胞，在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，產(chǎn)生多個(gè)完全相同的拷貝，即克??；
⑸.重組DNA隨宿主細(xì)胞分裂而分配到子細(xì)胞，使子代群體細(xì)胞均具有重組DNA分子的拷貝；
⑹.從宿主細(xì)胞中回收、純化和分析克隆的重組DNA分子；
⑺.使克隆的DNA進(jìn)一步轉(zhuǎn)錄成mRNA、翻譯成蛋白質(zhì)，分離、鑒定基因產(chǎn)物。

3．說(shuō)明在DNA克隆中，以下材料起什么作用。
(1)載體；(2)限制性核酸內(nèi)切酶；(3)連接酶；(4)宿主細(xì)胞；(5)氯化鈉
答：⑴. 載體：經(jīng)限制性酶酶切后形成的DNA片段或基因，不能直接進(jìn)入宿主細(xì)胞進(jìn)行克隆。一個(gè)DNA片段只有與適合的載體DNA連接構(gòu)成重組DNA后，在載體DNA的運(yùn)載下，才可以高效地進(jìn)入宿主細(xì)胞，并在其中復(fù)制、擴(kuò)增、克隆出多個(gè)拷貝。可作為DNA載體的有質(zhì)粒、噬菌體、病毒、細(xì)菌和酵母人工染色體等。
⑵. 限制性核酸內(nèi)切酶：限制性核酸內(nèi)切酶是基因工程的基石。在細(xì)菌中這些酶的功能是降解外來(lái)DNA分子，以限制或阻止病毒侵染。這種酶能識(shí)別雙鏈DNA分子中一段特異的核苷酸序列，在這一序列內(nèi)將雙鏈DNA分子切斷。
⑶. 連接酶：將外源DNA與載體相連接的一類酶。
⑷. 宿主細(xì)胞：能使重組DNA進(jìn)行復(fù)制的寄主細(xì)胞。
⑸. 氯化鈉：主要用于DNA提取。在pH為8左右的DNA溶液中，DNA分子是帶負(fù)電荷的，加入一定濃度的氯化鈉，使鈉離子中和DNA分子上的負(fù)電荷，減少DNA分子之間的同性電荷相斥力，易于互相聚合而形成DNA鈉鹽沉淀。另外，氯化鈉也是細(xì)菌培養(yǎng)基的成分之一。

4．有一個(gè)帶有氨芐青霉素和四環(huán)素抗性的質(zhì)粒，在其四環(huán)素抗性基因內(nèi)有一個(gè)該質(zhì)粒惟一的EcoRI酶切點(diǎn)，今欲用EcoRI位點(diǎn)克隆果蠅DNA，構(gòu)建一個(gè)基因庫(kù)，連接的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株DH5 ，試問(wèn)：⑴. 在培養(yǎng)基中加入哪一種抗生素用于選擇陽(yáng)性克隆？⑵. 對(duì)哪一種抗生素有抗性的質(zhì)粒攜帶外源果蠅DNA片段？⑶. 如果有的克隆可抗兩種抗生素，如何解釋？
答：⑴.在培養(yǎng)基中加入四環(huán)素結(jié)合影印法可用于選擇陽(yáng)性克隆。
⑵.對(duì)氨芐青霉素有抗性的質(zhì)粒攜帶外源果蠅DNA片段。
⑶.這種克隆是沒(méi)有受到EcoRI酶解的原始質(zhì)粒或這些克隆都是自連形成的非重組體。

5．在構(gòu)建一個(gè)真核生物核DNA庫(kù)時(shí)，需要考慮哪些因素？
答：核基因庫(kù)是將某一生物的全部基因組DNA酶切后與載體連接構(gòu)建而成的。通常方法是，盡量提取大分子量的核DNA，用限制性酶酶切后，分離選擇具有一定長(zhǎng)度（大于15kb）的DNA片斷，與適宜的載體連接構(gòu)成重組DNA分子，根據(jù)所用的載體，選擇相應(yīng)的宿主細(xì)胞用于克隆。若載體是質(zhì)粒，則將連接的重組DNA分子轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，收集所有的菌落即成為質(zhì)?；驇?kù)。如果載體是噬菌體或粘粒（cosmid），則將重組DNA分子體外包裝成噬菌體后，感染細(xì)菌細(xì)胞，將所得到的所有重組噬菌體集中即是基因庫(kù)。如果載體為BAC或YAC，將重組人工染色體導(dǎo)入相應(yīng)的宿主細(xì)胞，收集得到的所有細(xì)胞即成為基因庫(kù)。
　　真核生物的核DNA大，因此在構(gòu)建核基因庫(kù)時(shí)，通常要選擇能夠接受較大片段的載體，以減少克隆數(shù)量。若構(gòu)建的基因庫(kù)是以分離結(jié)構(gòu)基因?yàn)橹饕康牡?，通常選用λEMBL，λGEM，或粘粒。而那些將用于基因組作圖和分析的基因庫(kù)，則多選擇BAC或YAC為載體。

6．根據(jù)下列凝膠電泳分析的結(jié)果，構(gòu)建一個(gè)限制性酶圖譜，并表明酶切位點(diǎn)及片段的堿基數(shù)，片段總長(zhǎng)度為1300bp。電泳分析結(jié)果如下：

答：限制性酶切圖譜從左到右是，200個(gè)堿基對(duì)位置是酶II的切點(diǎn)；350個(gè)堿基對(duì)位置是酶I的切點(diǎn)；圖譜總長(zhǎng)是1300個(gè)堿基對(duì)。

7．在下列6種限制性酶圖譜中，有一種排列方式與凝膠電泳的帶型是一致的。3種酶分別是：E： EcoRI、N：NcoI、A：AatII。
試回答：⑴.根據(jù)電泳中DNA帶型，選擇正確的圖譜并說(shuō)明原因。
⑵.在將這塊凝膠轉(zhuǎn)移后進(jìn)行Southern雜交分析，帶星點(diǎn)的是與pep基因雜交的信號(hào)帶，說(shuō)明pep在圖譜中的位置。
答：⑴.從上到下的第五條應(yīng)該為正確的圖譜，因?yàn)榻?jīng)過(guò)上述三種酶切后，與左面的電泳圖完全一致。
⑵.根據(jù)Southern結(jié)果和酶切圖的位置，pep應(yīng)該在第五條圖譜的3與4之間。

8．簡(jiǎn)述將除草劑基因轉(zhuǎn)移到植物基因組的過(guò)程。
答：以農(nóng)桿菌介導(dǎo)為例，說(shuō)明這一過(guò)程。
⑴.在無(wú)菌的組織培養(yǎng)下，從植物體的種子或無(wú)性器官建立高效的再生體系；
⑵.依據(jù)植物的種類，選擇合適的質(zhì)粒載體，將抗除草劑的基因連接到載體上，再將質(zhì)粒引進(jìn)根癌農(nóng)桿菌；
⑶.植物的再生組織與上述農(nóng)桿菌共同培養(yǎng)；
⑷.經(jīng)過(guò)農(nóng)桿菌感染的組織在含除草劑的培養(yǎng)基中進(jìn)行選擇；
⑸.抗除草劑的組織再生植株；
⑹.再生植株在溫室進(jìn)行抗除草劑試驗(yàn)；
⑺.有性繁殖的種類還要進(jìn)行自交、回交測(cè)定和純化。

9．簡(jiǎn)述基因組遺傳圖譜與物理圖譜的異同。
答：遺傳圖譜的構(gòu)建是根據(jù)任一遺傳性狀（如已知的可鑒別的表型性狀、多型性基因位點(diǎn)、功能未知的DNA標(biāo)記）的分離比例，將基因定位在基因組中。因此，遺傳圖譜是根據(jù)等位基因在減數(shù)分裂中的重組頻率，來(lái)確定其在基因組中的順序和相對(duì)距離的。物理圖譜的構(gòu)建不需要檢測(cè)等位基因的差異，它既可以利用具有多型性的標(biāo)記，也可以利用沒(méi)有多型性的標(biāo)記進(jìn)行圖譜構(gòu)建，它將標(biāo)記直接定位在基因庫(kù)中的某一位點(diǎn)。
　　實(shí)際上這兩種途徑都需要利用分子遺傳學(xué)的技術(shù)和方法。盡管這兩種圖譜是分別構(gòu)建的，但是它們可以相互借鑒、互為補(bǔ)充，作為基因組圖譜利用。
　　構(gòu)建物理圖譜的原因是：遺傳圖譜的分辨率有限、遺傳圖譜的精確性不高。

10． 簡(jiǎn)述基因工程在工、農(nóng)、醫(yī)三方面的成就及發(fā)展前景。
答：基因工程在工業(yè)上的應(yīng)用主要是生產(chǎn)醫(yī)藥產(chǎn)品，最典型的例子是通過(guò)細(xì)菌生產(chǎn)胰島素，治療糖尿病。到目前通過(guò)細(xì)菌已經(jīng)生產(chǎn)了表皮生長(zhǎng)因子、人生長(zhǎng)激素因子、干擾素、乙型肝炎工程疫苗等10多種醫(yī)藥產(chǎn)品。
　　基因工程在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用：以轉(zhuǎn)基因植物為標(biāo)志的植物基因工程已經(jīng)培養(yǎng)出許多抗除草劑、抗蟲、抗病、抗逆的優(yōu)良品種和品系，如在全世界范圍內(nèi)大量推廣應(yīng)用的抗除草劑的大豆、抗棉鈴蟲的棉花等。通過(guò)轉(zhuǎn)基因羊大量表達(dá)人類的抗胰蛋白酶；克隆動(dòng)物的成功，可以挽救瀕危的稀有動(dòng)物。
　　基因工程在醫(yī)學(xué)上主要是用于遺傳疾病的診斷、基因的治療方面。
　　基因工程具有巨大和廣泛的發(fā)展前景，將滲透到人類生活的各個(gè)方面?？梢詣?chuàng)造出營(yíng)養(yǎng)價(jià)值更高、保健作用更好、抗逆性更強(qiáng)的植物種類；轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的進(jìn)展，可以生產(chǎn)出多種類的用于人類遺傳性疾病治療的藥物；人類基因組計(jì)劃的完成和基因定位的發(fā)展、尤其是核酸分子雜交原理和方法與半導(dǎo)體技術(shù)結(jié)合而發(fā)展起來(lái)的DNA芯片技術(shù)的出現(xiàn)和完善，將在人類遺傳疾病的診斷和治療等方面發(fā)揮重要作用。

第十章 基因突變

1．舉例說(shuō)明自發(fā)突變和誘發(fā)突變、正突變和反突變。
答：通過(guò)外界環(huán)境條件的自然作用，或由植物體內(nèi)生理生化變化而發(fā)生的突變，稱為自發(fā)突變。如壽星桃是由正常的桃突變而來(lái)（DwDw-Dwdw-dwdw）。自然條件下，水稻的矮生型、棉花的短果枝、玉米的糯性胚乳等性狀，都是基因自發(fā)突變的結(jié)果。
　　人為地利用物理、化學(xué)或其它因素影響而發(fā)生的突變稱為誘發(fā)突變。如輻射誘發(fā)引起的蘋果短枝型變異、人工誘發(fā)櫻桃緊湊型變異。
　　基因突變像許多生物化學(xué)反應(yīng)過(guò)程一樣是可逆的，即顯性基因A可以突變?yōu)殡[性基因a，而隱性基因a也可突變?yōu)轱@性基因A。前者通常稱為正突變，后者稱為反突變或回復(fù)突變。例如水稻有芒基因A可以突變?yōu)闊o(wú)芒基因a，而無(wú)芒基因a也可突變?yōu)橛忻⒒駻。

2．什么叫復(fù)等位基因？人的ABO血型復(fù)等位基因的遺傳知識(shí)有什么利用價(jià)值？
答：位于同一基因位點(diǎn)上的各個(gè)等位基因在遺傳學(xué)上稱為復(fù)等位基因。復(fù)等位基因并不存在于同一個(gè)體（同源多倍體是例外），而是存在于同一生物類型的不同個(gè)體里。
　　人的ABO血型就是由IA、IB和i三個(gè)復(fù)等位基因決定著紅細(xì)胞表面抗原的特異性。其中，IA基因、IB基因分別對(duì)i基因?yàn)轱@性，IA與IB為共顯性。根據(jù)ABO血型的遺傳規(guī)律可進(jìn)行親子鑒定等。

3．何為芽變？在生產(chǎn)實(shí)踐上有什么價(jià)值？
答：芽變是體細(xì)胞突變的一種，突變發(fā)生在芽的分生組織細(xì)胞中。當(dāng)芽萌發(fā)長(zhǎng)成枝條，并在性狀上表現(xiàn)出與原類型不同，即為芽變。
　　芽變是植物產(chǎn)生新變異的豐富源泉，它既可為雜交育種提供新的種質(zhì)資源，又可從中選出優(yōu)良新品種，是選育品種的一種簡(jiǎn)易而有效的方法。全世界有一半蘋果產(chǎn)量來(lái)自于芽變，如品種：元帥、紅星、新紅星、首紅、超首紅。

4．為什么基因突變大多數(shù)是有害的？
答：大多數(shù)基因的突變，對(duì)生物的生長(zhǎng)和發(fā)育往往是有害的。因?yàn)楝F(xiàn)存的生物都是經(jīng)歷長(zhǎng)期自然選擇進(jìn)化而來(lái)的，它們的遺傳物質(zhì)及其控制下的代謝過(guò)程，都已經(jīng)達(dá)到相對(duì)平衡和協(xié)調(diào)狀態(tài)。如果某一基因發(fā)生突變，原有的協(xié)調(diào)關(guān)系不可避免地要遭到破壞或削弱，生物賴于正常生活的代謝關(guān)系就會(huì)被打亂，從而引起程度不同的有害后果。一般表現(xiàn)為生育反常，極端的會(huì)導(dǎo)致死亡。

5．有性繁殖和無(wú)性繁殖、自花授粉和異花授粉與突變性狀表現(xiàn)有什么關(guān)系？
答：有性繁殖植物：性細(xì)胞發(fā)生顯性突變，則在后代中立即表現(xiàn)；如果是隱性突變，后代自交也可以得到純合的突變體。體細(xì)胞發(fā)生顯性突變，則以嵌合體形式存在；體細(xì)胞發(fā)生隱性突變，不能立即表現(xiàn)，如要使它表現(xiàn)則需要把隱性突變體進(jìn)行有性繁殖。
　　無(wú)性繁殖植物：體細(xì)胞顯性突變后，形成嵌合體，用嵌合體進(jìn)行無(wú)性繁殖，可以得到表現(xiàn)各種變異的嵌合體，也可能得到同質(zhì)突變體；發(fā)生隱性突變則無(wú)法通過(guò)無(wú)性繁殖使之得到表現(xiàn)。
　　自花授粉植物：一般自花授粉植物突變頻率低，遺傳上較穩(wěn)定，但是突變后容易表現(xiàn)，容易被檢出。
　　異花授粉植物：異花授粉植物突變頻率相對(duì)較高，但是突變后不容易被檢出。因?yàn)轱@性突變成雜合狀態(tài)存在，隱性突變大多被顯性基因遮蓋而不表現(xiàn)，只要在自交時(shí)基因型純合，才能表現(xiàn)。

6．突變的平行性說(shuō)明什么問(wèn)題，有何實(shí)踐意義？
答：親緣關(guān)系相近的物種因遺傳基礎(chǔ)比較近似，往往發(fā)生相似的基因突變。這種現(xiàn)象稱為突變的平行性。根據(jù)這個(gè)特點(diǎn)，當(dāng)了解到一個(gè)物種或?qū)賰?nèi)具有哪些變異類型，就能夠預(yù)見(jiàn)到近緣的其它物種或?qū)僖部赡艽嬖谙嗨频淖儺愵愋?，這對(duì)于人工誘變有一定的參考意義。

7．利用花粉直感現(xiàn)象測(cè)定突變頻率，在親本狀態(tài)配置上應(yīng)該注意什么問(wèn)題？
答：一般應(yīng)該用隱性純合體作母本，用顯性純合體經(jīng)誘變處理的花粉作父本進(jìn)行雜交。

8．在高稈小麥田里突然出現(xiàn)一株矮化植株，怎樣驗(yàn)證它是由于基因突變，還是由于環(huán)境影響產(chǎn)生的？
答：如果是在苗期發(fā)現(xiàn)這種情況，有可能是環(huán)境條件如土壤肥力、光照等因素引起，在當(dāng)代可加強(qiáng)矮化植株與正常植株的栽培管理，使其處于相同環(huán)境條件下，觀察它們?cè)谏L(zhǎng)上的差異。如果到完全成熟時(shí)，兩者高度表現(xiàn)相似，說(shuō)明它是不遺傳的變異，由環(huán)境影響引起的；反之，如果變異體與原始親本明顯不同，仍然表現(xiàn)為矮稈，說(shuō)明它可能是遺傳的變異。然后進(jìn)行子代比較加以驗(yàn)證，可將矮化植株所收種子與高稈小麥的種子播種在相同的環(huán)境條件下，比較它的后代與對(duì)照在株高上的差異。如矮化植株的種子所長(zhǎng)成的植株仍然矮化，則證明在高稈小麥田里出現(xiàn)的一株矮化植株是由于基因突變引起的。

9．試述物理因素誘變的機(jī)理。
答：本章所指的物理因素只限于各種電離輻射和非電離輻射。
　　電離輻射包括α 射線、β射線和中子等粒子輻射，還包括γ 射線和X射線等電磁輻射。電離輻射能使構(gòu)成基因的化學(xué)物質(zhì)直接發(fā)生電離作用。輕者造成基因分子結(jié)構(gòu)的改變，產(chǎn)生突變了的新基因，重者造成染色體的斷裂，引起染色體結(jié)構(gòu)的畸變。
　　本章所指的非電離輻射就是紫外線。紫外線造成基因分子鏈的離析。分子鏈已經(jīng)離析的基因在重新組合的時(shí)候，有可能發(fā)生差錯(cuò)而出現(xiàn)基因突變。紫外線特別作用于嘧啶，使得同鏈上鄰近的嘧啶核苷酸之間形成多價(jià)的聯(lián)合。最通常的結(jié)果是促使胸腺嘧啶聯(lián)合成二聚體；或是將胞嘧啶脫氨成尿嘧啶，或是將水加到嘧啶的C4、C5位置上成為光產(chǎn)物。它可以削弱C與G之間的氫鍵，使DNA鏈發(fā)生局部分離或變性。

10．試用紅色面包霉的生化突變?cè)囼?yàn)，說(shuō)明性狀與基因表現(xiàn)的關(guān)系。
答：射線照射后的分生孢子可誘發(fā)突變，讓誘變過(guò)的分生孢子與野生型交配，產(chǎn)生分離的子囊孢子，放入完全培養(yǎng)基里培養(yǎng)生長(zhǎng)（基本培養(yǎng)基上只有野生型能夠生長(zhǎng)，突變型均不能生長(zhǎng)），鑒定是否突變：
⑴.取出完全培養(yǎng)基中各組分生孢子，分別于基本培養(yǎng)基上，如果能夠生長(zhǎng)，說(shuō)明仍與野生型一樣，沒(méi)有突變；如不能夠生長(zhǎng)，說(shuō)明發(fā)生了變異；
⑵.把確定為突變型的各組材料，分別培養(yǎng)于加入各種物質(zhì)的基本培養(yǎng)基中，如某一培養(yǎng)基上能生長(zhǎng)，就說(shuō)明控制合成加入物質(zhì)的這種基因發(fā)生了突變；
⑶.如在上步2中確定為缺乏維生素合成能力的突變型，再進(jìn)一步在培養(yǎng)基中分別加入各種維生素分別培養(yǎng)這種突變型，如果其中一個(gè)能生長(zhǎng)，則說(shuō)明是控制該個(gè)維生素合成的基因發(fā)生了突變。
　上述生化突變的研究，清楚地說(shuō)明基因控制性狀，并非基因直接作用于性狀，而是通過(guò)一系列生化過(guò)程來(lái)實(shí)現(xiàn)的。